最近，血友病更有效的治疗方法，特别是基因治疗已经被开发出来。从血友病治疗中获得的经验教训将为其他遗传性疾病的基因治疗进展提供信息。
血友病是一种X-连锁先天性出血性疾病，每5 000例男性新生儿中就有1例受到影响，原因是F8或F9基因突变导致因子VIII（FVIII；血友病A）或因子IX（FIX；血友病B）不足。这些凝血因子在凝块形成中很重要，因此，患者有自发的创伤性关节和体腔出血。血友病管理的一个主要目标是通过每隔几天输注凝血因子（预防）来预防出血，以维持FVIII或FIX的浓度在1%以上以防止自发性出血。然而，因子输注是侵入性的，依从性差，使外源因子无效的因子VIII中和抗体（抑制剂）在高达30%的受者中发生，过去供体来源的因子导致的慢性丙型肝炎感染很常见。最近，血友病更有效的治疗方法，特别是基因治疗已经被开发出来。从血友病治疗中获得的经验教训将为其他遗传性疾病的基因治疗进展提供信息。
在过去十年中，非因子疗法的出现通过模拟缺失的凝血蛋白或抑制抗凝蛋白，增加凝血酶（FIIa）的生成，改善了止血效果，这是有或无抑制剂的患者形成纤维蛋白凝块所必需的（图1，见P50）。美国食品药品监督管理局（FDA）批准的双特异性单克隆抗体emizizumab模拟FVIII和桥梁激活因子IX和因子X，提高凝血酶生成。靶向组织因子途径抑制剂（target tissue factor pathway inhibitor , TFPI；血栓形成的主要调节因子）的单克隆抗体，如concizumab，通过防止血栓破裂来改善凝血酶的生成。抗凝血酶沉默RNA（antithrombin silencing RNA, siRNA-AT）fitusiran以剂量依赖性方式提高凝血酶的生成，AT活性降低至15%至20%。所有这三种药物都是通过皮下注射给药，这是患者首选的途径，并减少出血和因子使用。非因子疗法有几个优点：它们改善生活质量，通过减少因子的使用，可以防止新的抑制剂形成或消除现有的抑制剂，目前正在临床评估中。
尽管非因子疗法有好处，但仍然存在风险。非因子疗法可以预防但不能治疗出血，所以仍然需要标准因子来管理急性出血。非因子疗法在功能上可能不同于标准因子疗法，引起了人们对长期出血预防和关节健康的关注。例如，emicizumab在生物化学上与FVIII不同，因此不能与带负电的磷脂、血小板或血管内皮结合，对FIXa和FX的亲和力较弱。更令人担忧的是伴随因子和非因子疗法的动脉和静脉血栓形成的意外发生，如使用emizizumab的活化FIX（FEIBA）、使用抗TFPI的FVIII以及使用fitusiran的FVIII和重组FVIIa。建议减少因子和非因子治疗的剂量并谨慎监测，但还需要进一步的研究来确定使用这些药物的血栓形成的危险因素和机制。对于有凝血危险因素（如肥胖、高血压或糖尿病）的患者或遗传性或后天性血栓形成倾向的患者，是否应避免使用这些药物也是未知的。
鉴于因子和非因子治疗的持续挑战，单剂量基因治疗正在成为血友病的一种有希望的治疗方法。基于腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）载体的基因传递已被FDA和欧洲药物管理局（EMA）批准用于在体内纠正遗传性视网膜营养不良和脊髓性肌萎缩，为在其他单基因疾病中的应用铺平了道路。目前处于后期临床试验阶段，预计血友病基因治疗产品将在未来一两年内获得批准。
通过静脉注射，携带F9或F8基因的AAV载体在肝脏启动子的控制下，通过内吞作用进入肝细胞，并以胞外形式持续存在于肝细胞核中以产生信使RNA（mRNA），被翻译成功能性FIX或FVIII蛋白。
该蛋白质在内质网（endoplasmic reticulum, ER）和高尔基体中加工并释放到循环中。早期试验发现，在高剂量队列中，AAV表达的FIX约为正常值的5%，持续时间长达10年，FVIII浓度为正常值的10%至70%，持续时间长达5年。AAV F9和AAV F8基因传递似乎安全有效，出血和因子使用减少90%。
然而，AAV基因转移存在潜在风险，包括免疫原性、肝毒性、遗传毒性、插入突变、变异性和有限的持久性。早期AAV基因治疗的首要问题是针对载体转导肝细胞的宿主免疫反应。如果相关的肝酶在基因转移被识别并用皮质类固醇和（或）免疫抑制剂处理后增加达8周，这种T细胞反应可能被消除，但在某些情况下，转基因表达可能部分或完全丧失。
即使在缺乏宿主对载体的免疫应答的情况下，因子表达也可能较低，尤其是使用F8基因治疗时。这可能是因为FVIII通常在肝窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cells, LSECs）中产生，而不是在肝细胞中产生。克服FVIII低水平表达的方法包括通过引入肝脏特异性启动子和增强子优化载体结构、密码子优化和降低转基因的CpG含量。修改载体生产系统仍然很困难，因为产生AAV的昆虫细胞系需要比哺乳动物细胞系高10倍的载体剂量才能达到转基因表达水平。此外，一些优化方法导致肝酶增加[天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase, AST）和丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase, ALT）]，归因于肝细胞内质网应激。在血友病A小鼠体外细胞系中观察到大型FVIII蛋白的错误折叠，FVIII在ER中呈聚集的淀粉样球状，但这一点尚未得到证实，因为在小鼠中不存在这种现象的体内数据，并且很少在人类中进行活组织检查。已观察到以比临床试验更高剂量的全身给药的严重至致命AAV毒性，但这些是否反映AAV整合、表达蛋白的分子状态或AAV复制中间产物尚不清楚。
AAV肝基因治疗的另一个潜在风险是插入突变引起的遗传毒性。这通常被认为是低风险的，但与狗AAV基因治疗后10年内携带AAV整合的肝细胞克隆性扩增有关。尽管AAV载体主要是非整合的，但在新生小鼠中观察到AAV相关的肝细胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC），AAV整合在HCC肿瘤组织的特定基因组区域。然而，在接受AAV治疗的成年小鼠中，每个细胞的AAV拷贝数较低且没有HCC，这表明接受AAV治疗的新生小鼠中活跃的细胞分裂是HCC的基础，而不是插入突变。这一结论得到了原癌基因位点含有AAV整合的肿瘤的进一步支持，而且，当载体中使用强启动子时，新生代表达的促生长基因可能更容易整合。一名患有已知慢性丙型肝炎和乙型肝炎感染（通过供体衍生因子治疗传播）的成年患者，接受AAV5-hFIX-Padua后，发生了HCC，但在其肿瘤中未检测到载体整合。最终，需要对接受基因治疗的患者的肝组织进行直接测序，以确定该高危人群中基因治疗的整合频率和HCC风险。
表达的变异性，主要是F8转基因的变异性，已在试验中得到确认，并归因于载体剂量、载体血清型、载体生产系统、启动子的组织特异性、转基因效力以及转基因表达药代动力学的宿主差异。尽管功能获得F9 Padua基因变体的FIX表达允许毒性和变异性较小的低剂量载体，但没有可比的FVIII变体，因此，随着载体剂量的增加，FVIII表达的变异性和潜在毒性仍然是潜在的问题。
转基因表达的持久性也是一个挑战，主要是AAV FVIII基因治疗。尽管F9基因受体在长达10年的时间内具有持久的修复反应，且没有下降，但F8基因受体在长达5年后FVIII表达下降了50%或更大。在慢性丙型肝炎患者群体中，FVIII表达水平下降可能与高载体剂量、相关肝细胞毒性和内质网应激有关。
如何解决这些问题？一般认为，最佳血友病基因治疗应使用最低剂量的载体、肝脏特异性AAV血清型、肝脏特异性转基因启动子和哺乳动物细胞中的载体生产。此外，儿童AAV基因治疗受到与器官生长相关的组织增殖的限制，而成人AAV基因治疗则受到先前存在的中和AAV抗体的限制，载体再给药将有助于实现这一点。与载体疗法相结合的新兴方法包括IgG内肽酶或雷帕霉素纳米颗粒，以减少先前存在的中和AAV抗体，尽管这些策略仅对低中和抗体滴度（约1:20）有效。对于具有排除基因治疗的抗FVIII抑制剂的患者，可在基因治疗前给予耐受诱导方案，直到达到耐受，然后通过稳定的转基因表达维持耐受。
更通用的个性化方法包括使用CRISPR-Cas9进行基因编辑，CRISPR-Cas9有望治疗镰状细胞病和β-地中海贫血，在骨髓消融后提供基因编辑的CD34+造血干细胞和祖细胞。在血友病患者中，基因编辑方法被设计用于修复F8或F9突变或将F8或F9互补DNA（cDNA）靶向特定的基因组位点。虽然前者会有问题，因为几乎一半的F8基因突变和大多数F9基因突变是由于大的倒位突变引起的，不容易纠正，但cDNA方法的靶向是内皮细胞、肝窦内皮细胞、肝细胞、滋养层细胞、造血干细胞和间充质细胞，在血友病A和B小鼠中恢复FVIII或FIX表达和功能的一些方法。这种个体化治疗是有希望的，尽管安全性问题仍然存在，包括潜在的AAV毒性、靶点外编辑和体内给药系统的毒性。
为了确保开发治疗血友病和其他单基因疾病的最佳疗效和安全性，未来的研究必须专注于载体的设计（如慢病毒载体的开发），以尽可能减少免疫原性蛋白质，减少宿主免疫反应，并避免肝细胞毒性和遗传毒性。随着与因子疗法相比的持续进步和越来越多的成本效益证据，基因矫正有望实现安全、高效、持久的因子表达，并成为资源贫乏国家的标准疗法，在这些国家，因子是不可用且负担不起的。
参考文献：Margaret V. Ragni. Hemophilia as a blueprint for gene therapy[J]. Science,2021,374:40-41.