英国剑桥大学的Robertson等报告了利用释放的有义密码子，以令人印象深刻的高效率和多功能性将多个不同的ncAA位点特异性地结合到蛋白质中。
近乎保守的遗传密码控制信使RNA（mRNA），mRNA是蛋白质合成的模板，包含20种氨基酸。人工扩展遗传密码使非标准氨基酸（noncanonical amino acids, ncAAs）在活细胞蛋白质中的共翻译、位点特异性结合方面取得了进展。数百种不同的ncAA在生命的各个领域中被编码，使得这种新方法能够探究和操纵蛋白质功能。然而，这种方法在很大程度上仅限于将单个ncAA掺入多肽。英国剑桥大学的Robertson等报告了利用释放的有义密码子，以令人印象深刻的高效率和多功能性将多个不同的ncAA位点特异性地结合到蛋白质中。
将ncAA整合到活细胞蛋白质中涉及使用工程转运RNA（tRNA）–氨酰tRNA合成酶（aminoacyl-tRNA synthetase, aaRS），它们不会与宿主细胞的对应物发生交叉反应，并根据不同的密码子提供所需的ncAA——最常见的是重新分配的无义（终止）密码子。标准遗传密码（64个三联体密码子）的不灵活性阻碍了多个不同ncAA同时和不受限制地掺入。只有三个无义密码子可用于重新分配，从本质上限制了可以同时使用的不同ncAA的数量。此外，终止密码子的自然功能——释放因子介导翻译终止——与ncAA掺入竞争，影响解码效率。尽管通过同时重新分配三个终止密码子，可以对多达三个不同的ncAA进行位点特异性结合，但低效率限制了每个ncAA结合到每个多肽的单一位点上。
包含四个碱基的“移码”密码子已被研究用于替代无义密码子掺入ncAA。然而，对这种密码子的四个碱基中的前三个碱基的竞争识别，以及核糖体相对于三联体密码子的低效处理，降低了它们的解码效率。最近开发的可遗传的非自然碱基对可通过内源性转录和翻译机制进行处理，提供了可分配给ncAA的全新三联体密码子。但是，目前尚不清楚该技术是否适合在数量不受限制的位点中同时掺入多个ncAA。
在标准遗传密码中存在高度冗余。例如，三个密码子分配给翻译终止，而六个密码子分配给丝氨酸、亮氨酸和精氨酸。重新配置遗传密码以部分减少这种冗余，为释放ncAA的某些三联体密码子提供了一条有吸引力的途径。然而，要做到这一点，就需要全球基因组工程来消除所选择的三联体密码子的所有实例，以及它们的识别机制——这是一项真正艰巨的任务。首先在大肠杆菌（Escherichia coli）中得到证实，使用重组工程介导的定点突变方法将其中所有UAG无义密码子都替换为UAA。随后释放因子1的缺失消除了UAG的内源性识别，显著提高了该密码子处ncAA掺入的效率。这项工作证明了将ncAA分配给真正“空白”的三联体密码子的优势。然而，将这一方法扩展到释放相对于UAG数量大得多的有义密码子，已被证明具有挑战性。
为了克服这一局限性，Fredens等开发了一种高效的大肠杆菌基因组全球工程的简洁方法，称为REXER（复制子切除通过程序重组增强基因组工程）。这涉及到使用CRISPR-Cas9精确切除基因组的大片段，然后使用重组将其有效替换为合成的对应物。通过这种方法，作者设计了大肠杆菌菌株Syn61，其中丝氨酸密码子UCG和UCA以及终止密码子UAG的所有实例，分别被其同义密码子AGC、AGU和UAA所取代。当相应的同源tRNAs、serT和serU以及释放因子1从基因组中去除以产生菌株Syn61.Δ3，这项涉及超过18 000个密码子改变的基因组工程将UCG、UCA和UAG转化为空白密码子。
英国医学研究委员会的Robertson等使用Syn61.Δ3菌株证明了将ncAA分配给有义密码子的优势，从而使多位点ncAA掺入具有更高的效率和通用性（见图1）。Syn61.Δ3进化产生Syn61.Δ3（ev5），一种生长动力学显著改善的突变菌株。由于不能处理UCG、UCA和UAG，该菌株对不同噬菌体（感染细菌的病毒）的混合物具有抗性。然后，作者使用以前开发的古生菌衍生的酪氨酸和吡咯基对来扩展大肠杆菌的遗传密码，结合ncAA以响应释放的有义密码子。这使得两种不同的ncAA在最多三个不同的位点有效地掺入两个不同的ncAA，同时掺入三个不同的ncAA以响应UCG、UCA和UAG。长期以来，人们一直认为，释放一部分有义密码子进行重新分配可以提高遗传密码扩展技术的稳健性和通用性。这项工作巧妙地将梦想转化为现实，并证实了这些假设。
总之，Syn61.Δ3菌株的开发和应用为进一步压缩遗传密码和释放额外的有义密码子提供了蓝图。再加上相互正交的tRNA-aaRS对的发展，以有效地重新分配这些密码子，这些工作将以前所未有的通用性和高效性将许多不同的ncAA整合到蛋白质中成为可能。这将使无数的应用，包括定义序列的核糖体合成，基因编码的非天然生物聚合物。生成和进化这种非天然生物聚合物的能力与多肽具有相同的多功能性，可能对从医学到材料科学等学科产生广泛的影响。
参考文献：Jewel D, Chatterjee A. Rewriting the genetic code[J]. Nature,2021,372:1040- 1041.