人们对抗生素耐药性的认识提升值得庆贺，但想真正地破坏细菌的恢复能力还有很长一段路要走。从进化意义上说，细菌成功地利用人类作为宿主和载体。在这场战斗中，我们的潜在优势在于，细菌不仅要在人类不断进化的个体免疫反应中生存下来，还要在人类通过使用抗生素来弥补免疫缺陷的努力中生存下来。
抗生素是防治传染病的主要手段，在世界范围内广泛使用。但随着抗生素耐药性的增加，即细菌病原体对原来敏感的抗生素产生高度耐受性，使得抗生素失效，并给临床实践带来挑战。抗生素耐药性（AMR）可分为遗传型（稳定、可遗传的）和表型（可逆的、不是由遗传改变引起的）两种。本文从生物学角度分析了遗传型和表型AMR的产生机制，综述了AMR的最新进展和长久以来的局限性，并提出了应对方法，包括识别尚未开发的靶点、鉴定新的抗菌化合物和改进联合用药方案。
抗生素耐药性生物学
定义和概念局限性
遗传型AMR是由基因水平转移或基因突变引起的，可来自细菌自身的基因组突变或接受其他细菌的AMR基因。遗传型AMR使得细菌可以在更高浓度的抗生素环境中生长，通常会超过最低抑菌浓度（MIC）四倍。MIC是指抗生素能抑制培养基内同一病原菌生长的最低药物浓度。临床上，遗传型AMR通常会导致初级治疗失败，不得不寻找替代抗生素或其他有效的治疗方法。然而，面对越来越多的耐药性细菌感染，替代抗生素并不存在。
相对而言，表型AMR则不依赖于同一细菌种群中敏感细胞的遗传改变。表型AMR的存在与否，都不改变细菌种群生长的MIC，即不需要使用过高浓度的抗生素。表型AMR减缓了抗生素对细菌种群的杀伤速度，这种现象有时也被称为耐药性。表型AMR可由大多数杀灭率慢的细菌细胞或根本不会被杀死的细菌细胞亚群表达。当存活下来的细菌在无抗生素环境中继续生长时，所产生的菌群与初始菌群具有相同的MIC。
除了MIC外，确定抗生素效价的另一指标是MBC，即一定时间内杀灭一定比例菌群（通常是99%）的最低抗生素浓度。对于不断复制的细菌种群，常测定MIC和MBC99，后者可能与前者相同或更高。但在细菌非复制条件下，不能确定使用抗生素的MIC，此时MBC99会几何级增加，可能超出测试抗生素的浓度范围。这是表型AMR的极端例子。
表型AMR可以随机自发出现，或在环境改变时出现，比如营养或氧气缺乏、酸化、氧化应激、宿主免疫反应以及亚致死抗生素浓度暴露等。自发或环境诱导的表型AMR均可导致原发性治疗失败或复发。临床上常用的应对策略包括联合使用多种抗生素、使用非常规抗生素和延长抗生素使用时间。
然而，细菌适应机制的多样性增加了区分遗传型AMR和表型AMR的难度。例如，有一些可迅速恢复的AMR基因突变，可能表现为“克隆异质耐药性”，即细菌亚群中由单核苷酸多态性、核苷酸插入或缺失或基因扩增带来的短暂可遗传AMR。当细菌不再暴露于抗生素时，引起克隆异质耐药性突变的适合度代价会通过二次突变逆转或补偿。同样，表型AMR细菌的多代繁殖与克隆异质耐药性相似。例如，细菌组蛋白样蛋白的乙酰化或甲基化导致耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）中产生抗异烟肼的短暂可遗传的表型AMR。
抗生素的初级和次级作用
证据表明，抗生素通常通过其初级作用和常见次级作用结合，来杀灭处于正常或低氧环境中的细菌。在无氧环境中，抗生素只需初级作用就能杀灭细菌。
大多数抗生素的初级作用包括病原体在研究条件下的腐败过程和宿主细菌暴露于临床有效抗生素条件下的腐败过程。当然这些过程可能因条件不同而有所差异。
除初级作用外，抗生素与其主要靶点的结合经常引发一系列次级作用，从而导致活性氧（ROS）浓度增加，包括生成增加或分解代谢减少。这两种效应可能都源于抗生素初级作用导致的细菌代谢改变。然而，目前还不清楚抗生素是如何通过抑制细菌核酸、蛋白质和细胞壁合成来影响其新陈代谢的。次级作用可能会因抗生素和细菌种类的不同而不同。一项研究发现大肠杆菌对氨苄西林、环丙沙星和庆大霉素的代谢反应与这些药物的致命作用有关，如增加通过中心碳代谢的通量和腺嘌呤的明显缺乏。后者导致腺嘌呤合成增加，三磷酸腺苷合成增加，消耗氧气，导致ROS生成增加。当细菌细胞中不再有抗生素且抗生素初级作用已经停止时，诸如ROS的生成等次级作用仍会继续。
ROS可以通过破坏细菌大分子和代谢物，损害电子、质子和其他离子的传输，从而导致抗生素的致命性。例如，蛋白质的错误折叠会导致毒性功能的丧失或获得，以及进一步生成ROS。这些毒性效应可以通过细菌ROS解毒反应和分子修复途径（包括蛋白质再折叠和DNA修复）以及大分子的降解或螯合来抵消。
遗传型AMR的认识差距
遗传型AMR几乎出现在每一种临床应用的抗生素中，因为它的存在严重阻碍了制药公司之间的竞争。除了用于治疗感染，有更多的抗生素被用于促进农牧业食用动物的生长。其结果是，抗生素在健康人尿液中普遍存在，这可能加速了耐药细菌的选择。另外，世界各地的其他做法，包括为治疗病毒性疾病开具抗生素处方、无处方使用抗生素和抗生素销售方开抗生素处方等，也在加剧遗传型AMR的产生。
遗传型AMR机制中最著名的是抗生素靶点突变，这种突变降低了药物的结合，但保留了足够的靶向物功能，来维持病原体复制的能力。突变导致靶向物翻译后修饰具有相同效果，靶向物表达增加以致于抗生素在细胞内聚集不足，不能够阻止细胞复制、化学修饰药物不再与靶向物结合、药物分解代谢增加、药物排出增加、药物吸收减少、前药激活减少和一种补偿靶抑制途径的表达。近期还发现另外一种新机制：一种生理作用与抗菌剂作用相反的酶的功能丧失。
以上这些遗传型AMR机制属于抗生素的初级作用，另外还有导致活性氧增加的次级作用机制。与减少抗生素的初级作用机制相比，增加对抗生素次级作用的耐药性突变所带来的MIC增加要小一些。这种改变被认为在实验误差之内，突变的细菌不被归类为具有耐药性。即便突变已经发现，但并不被认为与AMR或抗氧化防御有关，因为细菌细胞在应激期间产生更少ROS和更多还原能力的过程复杂，目前还不能完全被理解。
理解表型AMR的重要性和难点
表型AMR比遗传型AMR更常见。这种判断在临床上是合理的，因为生物膜中普遍存在表型耐药细菌，以及很多临床环境中普遍存在细菌生物膜。从基础科学方面来看，致使遗传型AMR的新突变在体外发生频率为10-6到10-9，而表型AMR的发生频率接近于100。
表型AMR可通过多种机制诱发遗传型AMR。例如结核分枝杆菌、耻垢分枝杆菌和大肠杆菌在一次产生ROS的抗生素中存在下来。ROS或细菌细胞对它的反应是诱变性的，导致产生针对同一种抗生素或其他抗生素的遗传型AMR。在大肠杆菌中，增加表型AMR频率的突变先于遗传型AMR的突变，可能是因为它们增加了特定抗生素暴露周期中幸存者的数量，在随后突变中可能会产生遗传型AMR。此外，表型AMR的一些机制会抑制DNA修复，从而产生遗传型AMR突变。而且，表型耐药细菌的存活使它们能够利用可能含有的质粒转化其他细菌，从而让其他抗生素也具有遗传型AMR。
对表型AMR的研究停滞了几十年，不仅因为这种现象是短暂的，而且它通常只涉及到细菌种群中非常小的一部分，即持续存在的细菌。这种细菌细胞很难与表达遗传型AMR的细胞区分开来。不过最近随着单细胞分析、细胞分选、基因组学和代谢组学技术的进步，对表型AMR的认识之门已经打开。
对表型AMR的新认识
最近研究发现，细菌非复制（或缓慢复制）不是表型AMR产生的必要条件，即使存在，也不一定是对AMR机制的解释。有人提出，只要结果不依赖于与抗生素作用机制直接相关的基因的稳定遗传突变，表型AMR可以产生于任何遗传型AMR的机制。表型抗生素的遗传控制研究为抗生素研究提供了一条富有成效的途径。
表型AMR是不稳定遗传的，然而，表型耐药菌在种群中的比例是受遗传控制的。高持久性突变（hip）增加了细菌种群中表型AMR的出现比例。根据定义，在复制的细菌种群中，表型耐药菌的比例低于用于表征抗生素效力分析的灵敏度的比例限制。例如，对某一细菌种群，抗生素的MIC和MBC99相等，如果表型耐药菌比例超过10-2，MBC99就会上升。高持久性突变将表型耐药菌比例从典型的10-6提高到10-2(四个数量级)，而不升高MBC99。
与高持久性突变相反，低持久性突变降低细菌种群中表型AMR的比例。通过低持续性突变研究确定的许多途径与高持久性突变影响的途径重叠，如毒素-抗毒素模块、严格反应、群体感应、σ因子和脂质代谢。其他低持久性突变还会影响蛋白质稳态。
细菌在体内的持久性及其治疗意义
细菌的“体内持久性”是临床中的主要问题。耐药细菌可能由于表型AMR之外的原因而持续存在，比如遗传异质性。此外，细菌还可能存在于抗生素不能达到或维持杀菌浓度的地方。尽管如此，表型AMR通常是细菌持续存在的原因。如果一种药物不能很好地穿透特定的病理生态位达到杀死细菌的MBC，那么可能诱导联合治疗中的其他药物产生表型AMR。简言之，原以为的抗生素与宿主免疫之间或两种抗生素之间的协同作用可能是拮抗作用。
通常在细菌种群中只有一小部分细菌具有表型AMR，且不同的细菌通常对不同的抗生素有表型抗性。由于大多数细菌会表达表型AMR，并对多种常规抗生素产生抗性，因此联合用药可能无效。相反，在非传统标准下可能鉴别出有效化合物，比如具有杀死非复制细菌能力的化合物。根据ROS在扩大抗生素作用中的作用，这类药物的靶点可能是介导抗氧化防御的酶。另外，还可以通过增加细菌ROS的产生，抑制细菌的“进化能力”或阻止细菌产生表型AMR的表型异质性能力。问题是，我们该如何更有效地确定合适的细菌靶点使得抗生素可应用到临床，并预测哪些抗生素联合将起到协同作用而非拮抗作用。
抗生素发现新工具
靶点选择
抗生素发现的首选途径是对原有靶点（临床批准应用的抗生素抑制靶点）研发出新的抑制剂，以弥补原有抗生素诱发出遗传型AMR的不足。
第二个传统的靶点选择标准是细菌靶点必须缺少人类同源物，尽可能降低新抗生素对宿主的毒性。这种做法可能会浪费机会，因为小到改变一个活性位点氨基酸残基的侧链或那些远离活性位点的一些氨基酸残基的侧链，就足以使细菌酶的抑制剂具有物种特异反应性，而不涉及它的人类对应物。
最后，当寻找新的靶点时，通常在标准实验室条件下选择已知对病原体至关重要的靶点。当一个在标准实验室条件下是必需的基因产物在被感染的宿主中被证明不是必需时，对这些常规必需目标的关注会让人失望。
复合分析
抗生素开发的先导进展涉及从三个方面来确定其构效关系：对靶点的效力，对抗病原体的活性，以及一系列药理特性，例如：吸收、组织分布、代谢、排泄和毒理学。药物化学家合成数百种抑制剂变体来优化这些参数，但这些研究仍停留在经验阶段。
最近的两项新进展有助于确定抗生素构效关系：细菌内药代动力学和细菌内药效学。液相色谱－质谱联用技术（LC-MS）可定量分析抗菌化合物的体内浓度及其转化为其他产物的情况，确定哪些产物可以介导结构修饰以阻止化合物分解代谢。这些信息可用来开发预测算法来指导化合物的选择和设计。
药物治疗方案设计
联合使用抗生素是一种有效的治疗手段。借助新的遗传方法、代谢组学和药理学可以模拟和预测不同抗生素间的协同/拮抗作用，利用这些信息制定新的给药方案。
结论
人们对抗生素耐药性的认识提升值得庆贺，但想真正地破坏细菌的恢复能力还有很长一段路要走。从进化意义上说，细菌成功地利用人类作为宿主和载体。在这场战斗中，我们的潜在优势在于，细菌不仅要在人类不断进化的个体免疫反应中生存下来，还要在人类通过使用抗生素来弥补免疫缺陷的努力中生存下来。我们对遗传耐药性的科学理解是可靠的，但对于表型抗生素耐药性的认识才刚刚起步。需要科学研究和社会共同努力来对抗耐药性细菌的威胁。（编译：李伟）
参考文献：Science Translational Medicine 2020;12,eaaz6992