低氧、p53和肿瘤细胞凋亡之间的关系

大多数实体瘤中都存在一些慢性低氧区域，原因是异常血管形成和氧合血供应不足。肿瘤的低氧环境的存在往往和治疗抵抗、预后差相关联。在严重的低氧环境下（氧气含量<0.1%，或者氧分压<0.8mmHg），还没有发生明显的DNA损伤之前，抑癌基因p53就会变得稳定，并发生活化磷酸化。Graeber等人研究发现，在发生癌变的细胞中，低氧条件下，p53的缺失会抑制细胞凋亡的发生，然而同基因的p53感受态细胞在发生癌变转化后，对低氧环境诱导的细胞调亡非常敏感。

低氧诱导的p53依赖的促凋亡基因的类别目前还不太清楚，低氧环境下p53的转录调节活化机制还存在争议。所以Leszczynska等研究人员对严重低氧环境诱导的p53依赖的细胞凋亡的新机制进行了研究。

研究发现，在许多人类肿瘤中，编码p53蛋白的基因发生了突变，该研究发现使我们对肿瘤在严重低氧环境等压力条件下，p53缺失或是发生突变后对肿瘤细胞存活中的作用的理解有帮助。研究结果可以提供潜在的治疗手段来治疗低氧环境下的肿瘤。

首先，Leszczynska和同事们明确了低氧环境下诱导的p53依赖的促凋亡途径，不同于DNA损伤诱导的p53途径。尤其需要提出的是，Leszczynska等人检验了p53缺失的细胞中DNA上的p53结合域（尤其是赖氨酸乙酰化位点K120和K164），在低氧诱导下发生细胞凋亡中起到的功能。

K120和K164这两个位点的乙酰化是DNA损伤诱导的p53依赖的细胞发生凋亡所必需的条件。在低氧诱导的启动子的转录调控下，转染了编码不同p53结构的质粒的细胞发生凋亡，然而，赖氨酸残基突变为精氨酸并没有对细胞调亡产生明显的影响。p53的DNA结合域结构（R175H突变体）的破坏，强烈抑制了低氧条件下细胞凋亡的发生。

这些结果提示，在低氧条件下，DNA结合位点的功能是p53依赖的细胞凋亡过程所必需的，但是p53 DNA结合位点的乙酰化却不是必要的。

低氧时p53依赖的细胞凋亡过程中的基因

Leszczynska和同事们确定了6个p53依赖的基因：INPP5D、PHLDA3、SULF2、BTG2、CYFIP2和KANK3，它们在严重低氧条件下的p53感受态细胞中被诱导发生转录，除KANK3有抑癌功能外，其余基因都和凋亡相关。相反，经典的p53依赖的促凋亡蛋白基因BAX、PUMA、NOXA和BID并没有在低氧条件下诱导发生转录。

Leszczynska和同事们运用染色质免疫沉淀技术，发现在低氧条件下，p53能够结合到启动子/增强子区域，这些区域包含INPP5D、PHLDA3、SULF2、CYFIP2和KANK3基因中的反应元件。有趣的是，典型的低氧诱导因子HIF-1α并没有表达。

之前，Fei等研究人员报道了低氧条件下HIF-1α和p53协同结合到Bnip3l启动子上，可以诱导表达促凋亡基因Bnip3l。Leszczynska和同事们的研究发现了相反的结果，表明p53在低氧条件下会表现出转录抑制活性。p53的转录活性很可能受潜在的复杂机制的调控，依赖于靶基因、细胞类型以及低氧的水平等因素。

低氧时p53依赖的细胞凋亡的机制

Leszczynska和同事们对不同种类的癌症患者的基因表达数据进行了分析，发现6个低氧诱导的p53靶基因的表达全部受到抑制与预后差强烈相关。这些p53依赖的基因表达的抑制是否和肿瘤低氧直接相关是一个非常有趣的研究内容。

所以，Leszczynska和同事们进一步评价了INPP5D和PHLDA3的功能，这两个基因已经证实可以通过抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine-threonine kinase，AKT）来促进细胞凋亡。PHLDA3可以编码普列克底物蛋白（pleckstrin）的同源结构域包合蛋白，该蛋白可以结合到细胞质膜的磷酸肌醇上。INPP5D编码的肌醇多磷酸盐-5-磷酸酶（即SHIP-1），可以负反馈调控细胞增殖和存活。

在野生型的表达p53的细胞中，低氧条件下通过激活内源启动子，短小的INPP5D转录体表达会优先增加。在p53缺陷的细胞中，低氧条件下PHLDA3的过表达显著增加了细胞凋亡。相反，将INPP5D或PHLDA3基因敲除后，可极大地提高野生型细胞的存活率。

此外，将SHIP-1进行活性抑制的同时敲除PHLDA3基因，会进一步抑制低氧条件下诱导的细胞凋亡。在低氧条件下，PHLDA3基因的敲除和SHIP-1酶的抑制可以导致AKT发生持续的磷酸化。

据此，Leszczynska和同事们提出假设：在低氧条件下，如果对AKT进行抑制，p53缺陷细胞的凋亡会增加。正如预测的一样，研究人员将肿瘤移植模型小鼠用电离辐射处理后，再用AKT抑制剂MK-2206处理，可以增加p53缺陷细胞的凋亡，抑制肿瘤的生长。

许多肿瘤中都存在AKT活化（测量S473的磷酸化水平即可），包括乳腺癌、头颈癌和肺癌。Leszczynska和同事们研究发现，在低氧条件下，p53缺陷细胞发生了持续的AKT-S473磷酸化，但是在表达p53的细胞中却没有这样的现象。

在低氧条件下，表达p53的野生型细胞中，AKT的活化受到INPP5D和PHLDA3基因产物的负调控，提示降低INPP5D和PHLDA3的表达可以导致p53缺陷细胞在低氧条件下发生持续的AKT磷酸化。

综上所述，遗传毒物（例如电离辐射疗法）联合AKT抑制剂有希望用于AKT疗法耐受的低氧肿瘤细胞治疗，从而改善肿瘤患者的临床预后。

总结和展望

值得注意的是，在几种主要的肿瘤中，平均氧分压大约是10mmHg（或1.3%O2）。此外，肿瘤内部的低氧程度和分布水平并不一致，持续时间也不同。所以，Leszczynska等人提出的AKT参与的低氧条件下的细胞凋亡机制，仅在氧浓度小于0.5%或氧分压小于0.8mmHg的瘤体内适用。低氧可以通过多种表观遗传机制，全方位、有选择地影响基因表达。低氧诱导的表观遗传修饰有可能和p53依赖的转录过程相互作用，甚至是改变p53的功能。根据细胞所处的位置或低氧本质的不同，p53可从一个转录活化因子转变为转录抑制因子。

AKT抑制剂是当前临床研究的热点，Leszczynska等人的研究发现了AKT抑制剂的新用途，未来可能在肿瘤治疗中得到广泛应用。

（作者：包丽霞、邱梅)

参考文献：Journal of Clinical Investigation 2015;125:2264-2266