结
核病是一种严重危害人民健康的慢性传染病，由分枝杆菌（Mycobacterium
tuberculosis），又称结核杆菌导致。全球所有死亡人群中约3%可归因于结核病，结核病的确是人类的一大公敌。结核病是青年人容易发生的一种慢
性和缓发的传染病，一年四季都可以发病，15岁到35岁是结核病的高发年龄，潜伏期4周～8周。其中80%发生在肺部，其他部位（颈淋巴、脑膜、腹膜、
肠、皮肤、骨骼）也可继发感染。人与人之间呼吸道传播是本病主要传染方式。传染源是接触排菌的肺结核患者。在我国，随着解放后人们的生活水平不断提高，结核已基本控制；但是，随着环境污染和艾滋病的传播，结核病发病率呈现反弹趋势。
我国是世界上
22个结核病高负担国家之一，我国三分之一左右的人口已感染了结核杆菌，受感染人数超过4亿。我国现有肺结核病人约500万，主要集中在25岁及以上人
群；其中痰菌阳性肺结核病人150万；每年约有13万人死于结核病，死亡平均年龄为55.2岁。据研究，受结核菌感染的人群中，10%的人会发展为结核
病。如果不采取有效的控制措施，在未来的10年，我国可能有近5000万的感染者发生结核病。
然而，在治疗结核病的过程中，人们遇到了一个难题——耐
药性。耐药结核杆菌，尤其是多药结核杆菌的出现和传播，是导致结核病发病率升高的重要原因。多药耐药性(multiple-durg
resistance ，MDR)结核病是指对利福平和异烟肼产生耐药性。而MDR结核病很有可能进化演变成广泛耐药性（extensively
drug-resistance，XDR）结核病。相应地，一种新的病人亚群产生了——因为长期治疗费用而致贫困的病人。而这每年对全球造成了巨大的损失。因此，弄清结核杆菌的进化及其产生耐药性的原因便显得尤为重要。
比较基因组学
已经揭示了结核杆菌的致病机制和进化的基本过程。然而，要解开其复杂的致病性以及耐药表型，却面临着重重困难。更糟糕的是，临床上对于该菌的分类使得这一
过程更为艰难。临床上根据已经确定的耐药相关突变或者对单一应用的药物临界浓度产生的耐受现象，将结核杆菌菌株分为易感型和耐药型。但是，这种二分法的分
类体系并没有解释菌株药物易感性的范围。现在，三个关注这个问题并且互相独立的研究为我们展示了如何运用全基因组测序技术对结核杆菌临床以及实验室数据进
行比较分析，来鉴别出现耐药性背后可能的基因突变。将这三个研究结合起来看，我们意外地又发现了一些耐药相关的基因突变。这使得我们对耐药性背后的遗传学
多样性又有了新的理解和认识。
虽
然结核病的化学治疗大约在70年前就已经开始应用，但是其对于结核杆菌展现出了一定的选择性。现代结核杆菌菌株是如何适应药物压力的呢？为了研究结核杆菌
与其专属性人类宿主之间共进化的可能性，另外一个关注结核杆菌的研究把焦点放在了进化时间轴的另一端，并为我们思考这个问题提供了新的思路（见上图）。
MTBC菌株的进化
所
谓结核杆菌复合体（M. Tuberculosis
complex，MTBC），是一组可以导致结核病、并且高度相关的结核菌。2013年，Comas等测序并分析了全球259个不同的MTBC。通过系统
发生学分析，研究者发现，MTBC菌株大约在7万年前就已经出现在非洲大陆上。通过将结核菌的进化史与相应的约5000个能够代表主要人类单倍群的线粒体
基因组进行比较分析，研究人员推测，MTBC菌株与现代人之间存在密切的共进化现象，因为这些人曾经都是从非洲迁徙而来，并且到达了
全球各个地区。Comas等发现，大约在1万年前的新石器时代人口大迁徙的过程中，全球人口密度飙升，而这对于结核杆菌的传播起到了关键作用。作者指出，
人类人口学是一个非常强的选择力。然而，这些研究结果还应该与最近的研究结果进行比较，因为这些最新的研究往往反对人类与MTBC的共趋异现象。
耐药性
在
上文提到的三个研究中，有两个研究是通过收集大量的结核杆菌临床分离株来寻找耐药性的遗传标记的。而其中一篇来自Farhart等的研究，挑选了123个
结核杆菌菌株并进行了全基因组测序。这123个菌株包含了来自社区传播链或者结核病患者的进展性耐药分离株，并且覆盖全球主要结核杆菌品系。由于结核杆菌
具有多样性，克隆扩增（clonal
expansion）可能会妨碍检测的应用，因此，Farhart等并没有使用传统检测选择压力特征的方法。相反，他们运用了一个新的系统发生学收敛测试
来对11个已知的耐药决定因子以及39个新的位于30个基因以及基因间区（intergenic
regions,IGRs）的独立突变目标（targets of independent
mutation，TIMs）进行检测。研究人员发现，有相当一部分TIM可以与大型PE/PEE家族基因匹配，而该家族基因所编码的蛋白在结核杆菌致病
机制中的准确作用尚未阐明。另外5个TIM位于与细胞壁生物合成或重塑相关的基因里。更重要的是，该研究的作者发现了其中1个基因——ponA1的具体的、能够导致药物易感性的突变。并且，他们通过实验确认了其功能性的影响。
另
外一篇类似的研究是来自于Zhang等人的。Zhang等研究人员对161个来自中国的结核杆菌菌株进行测序，而这些菌株几乎都是来自于品系2（主要来自
于东亚）或者品系4（主要来自于欧洲）。研究人员搜索了这些菌株中与耐药性高度相关的基因、IGR以及非同义单核苷酸多态性（single
nucleotide
polymorphism，SNP）。由于受限于MDR分离株和XDR分离株，他们最初的分析仅仅发现了许多已知的耐药相关基因。然而，将这个分析应用到
全体菌株上去以后，研究人员进一步发现了70个基因（包括3个已知的耐药基因）以及19个与对目前一、二线结核病药物耐药相关的IGR。利用非同义SNP
与同义SNP比值（dN/dS比值）的方法来衡量选择的影响后，研究人员发现，抗生素压力对于结核杆菌基因组产生了正向的选择效果，并且有许多位点都显示了这个正向选择的迹象。至少对该研究的161个菌株而言，这个抗生素压力与该研究发现的84个耐药相关基因几乎完全匹配。
以
上两个研究不但发现了一些值得我们深入研究的多药耐药相关候选基因，而且还提供了IGR与耐药性之间“吊足人们胃口”的联系。
而这又与我们目前日益认识到的结核杆菌非基因区域的潜在作用相一致。这些研究同时还在药物敏感的菌株中检测到了与耐药相关的突变，分析结果表明，这些突变
可能显示了一些早期耐药性基因序列的获得事件，也有可能为结核杆菌提供了增强的适应优势。对于耐药结核杆菌菌株进行逐个分析也得到
了类似的结果：XDR是通过与二线药物耐药相关突变的不断积聚而产生的，并非是一小部分导致广谱药物抗性的基因突变造成的。这些研究同时强调了细胞壁重塑
通路与耐药性的相关性，因为最近不断有研究开始观察到这个现象。这很有可能成为我们将要面临的新主题。此外，还有许多曾经已知的与耐药相关的基因并没有出
现在上述两个研究中，比如rpsA。而该基因正是一线结核病药物吡嗪酰胺（pyrazinamide）的药理基础。
在第三个研究中，Safi等结合体外挑选和分子遗传学技术，对结核杆菌乙胺丁醇耐药性的进化有了新的见解。重要的是，该研究表明，高水平的乙胺丁醇耐药性是分步获得的。根据Safi等的模型，embB突变会导致细胞壁前体DPA（decaprenylphosphory-β-D-arabinose）的生物合成通路突变（Rv3806c）或利用通路的突变（Rv3792），
最终又会导致embC的突变。通过对Rv3792的研究，Safi等第一次为我们展示了一个关于同义SNP与结核杆菌耐药性关联的例子。而且
Rv3806c（UbiA）蛋白功能与另外一个称为DprE1的酶串联，而DprE1是目前新的抗结核药物的一个非选择性的靶点。DprE1与
Rv3806c共同存在于同一个生物化学通路，而与此一致的是，乙胺丁醇并不能与已知的DprE1抑制剂发生协同作用；然而，我们依然饶有兴趣地思考，是
否dprE1突变体与对乙胺丁醇耐药性的不同易感性有关。最终，研究人员分别在体外以及临床分离株中发现了Rv3806c基因的突变。但是，Zhang等
发现，与这个基因在乙胺丁醇耐药性中已知的作用不同的是，这个基因在氟喹诺酮耐药性中的作用更为复杂。此外，Safi等的这次研究及其团队的先前的研究都
发现了Rv3806c相关表型的差异性，这也表明了另外一个类似的非关联现象。
结核病的治疗与防治
综上所述，本
文着重讨论的这些论文都扩大了结核杆菌耐药性的生物标记范围。而且这些论文的结果都一致表明，虽然低水平耐药性的问题实际上比较严重，但是以目前的诊断方
法可能还不能精确检测。因此，这些研究的结果不但对于全球结核病的防治工作具有深远的意义，而且对改进目前临床微生物学方法的建议起到了促进作用，即使用
高通量全基因组测序技术来进行常规诊断和药物易感性测试。同时，对于耐药性的遗传学信息也在不断完善，这很有可能为将来的临床管理以及治疗选择提供有力的
支持。虽然这些目前都只停留在可能性的层面上，但是对于诸如非洲南部等结核病肆虐的区域来说，必然会带来新的希望，而且意义非凡。
（作者：费正弦、李秋实)
参考文献：《Nature Genetics》2013;45:1107- 1108