胚胎干细胞

1995年,美国威斯康星大学的Thomson从恒河猴囊胚中分离并建立了第一个灵长类的胚胎干细胞系。随后几年，Thomson领导的小组将体外受精的早期胚胎在体外培养至囊胚期，利用免疫外科手术去除透明带，用培养液体外培养人囊胚内细胞群，9天～15天后将长出的细胞团吹散或者用胰酶消化，然后继续在滋养层细胞上培养，挑选未分化的单克隆细胞，吹散成50～100个细胞的细胞团后再继续培养，重复操作直至形成细胞系。研究人员从14 个囊胚中，最终建立起5 个人类胚胎干细胞系：H1、H7、H13、H14、和H19。这些细胞系继续培养5～6 个月，传32 代后仍可继续生长。这是人类首次从体外受精形成的囊胚中分离并建立了人类胚胎干细胞系，Thomson也因此被称为“胚胎干细胞之父”，相关研究论文于1998年发表在《Science》杂志。Cowan等在2004年的《New England Journal of Medcine》上发表文章称他们在已有15个胚胎干细胞系基础上，成功建立了17个新的干细胞系，并将这些新的干细胞系分给世界各实验室供研究人员使用。由于胚胎干细胞的研究会引起人类伦理道德问题，研究人员急需找到一种新的方法使人类体细胞转变成多能干细胞。日本京都大学Yamanaka研究小组在这方面做出了杰出的贡献。

诱导多能干细胞

2006年，日本京都大学Yama-naka研究小组采用体外基因转染技术， 希望从24个基因中筛选出能使成体细胞转变成干细胞的基因。通过研究他们确定了Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4四个转录因子基因。通过逆转录病毒将上述4个转录因子基因导入小鼠胚胎成纤维细胞中。在胚胎干细胞培养条件下，以Fbx15为标记物进行筛选，获得了Fbx15+的干细胞。新获得的这种细胞系在细胞形态、生长特性、表面标志物等方面与胚胎干细胞非常相似, 因此命名诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPS）。该项研究结果发表在2006年《Cell》杂志上。

2007年，Yamanaka研究小组进一步用Nanog代替Fbx15进行筛选， 得到了Nanog+的诱导多能干细胞系。2007年新获得的iPS细胞比2006年获得的iPS细胞更接近小鼠胚胎细胞，几乎完全相似。2007年11月， Yamanaka研究小组利用基因重组技术, 将上述同样的4个转录因子导入到人类皮肤成纤维细胞中， 也成功获得了iPS细胞。该项研究结果发表在2007年《Cell》杂志上。同年，美国威斯康星大学的Thomson研究小组利用了Oct4、Sox2、Nanog和Lin28四个基因，成功将人类体细胞转化为iPS 细胞。该项研究结果发表在2007年《Science》杂志上。在2008年亚太风湿病联盟学会(Asia Pacific League of Associations for Rheumatology，APLAR)大会上，Yamanaka将他们研究团队的研究成果汇报给世界各国专业人士。

2008年《Science》杂志报道了Yamanaka研究小组利用病毒将Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4四个基因成功导入实验鼠的肝和胃细胞，成功转成iPS干细胞。2008年《Nature》杂志报道了德国Conrad S等研究人员成功地将成人睾丸中的精原细胞分化、培养出干细胞。这种干细胞经过细胞学和分子学鉴定，显示出与人体胚胎干细胞相同的特性。

病理细胞来源的诱导多能干细胞

随着研究的不断深入，不仅正常细胞可以成为干细胞的来源，一些来自于病人的细胞也成为干细胞的来源。2008年《Science》杂志报道称哈佛大学的John Dimos及其同事利用来自一位罹患肌萎缩性脊髓侧索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS)的82岁老年病人的皮肤细胞，导入四种基因，将细胞进行重新编程，成功将皮肤细胞转变成诱导多能干细胞。2009年《Nature》杂志报道称，美国威斯康星大学的Thomson研究小组将一个患有脊髓性肌萎缩(Spinal muscular atrophy，SMA)儿童的皮肤细胞制成诱导多能干细胞。研究发现，这种诱导多能干细胞可以分化为具有SMA特征的运动神经细胞。这一研究为创建病理模型，实施药物筛查提供了一个可靠的方法。

载体从病毒到质粒，制造安全的iPS

在干细胞的一系列相关研究中，将基因转入细胞中，有一个不可或缺的中间力量——载体。2006年日本京都大学Yamanaka研究小组，通过逆转录病毒将Oct4、Sox2、 c-Myc、Klf4四个转录因子基因导入胚胎小鼠成纤维细胞中。但由于基因植入的载体——逆转录病毒会整合到宿主细胞的基因组内，进而可能会诱发肿瘤的形成，因此逆转录病毒的安全性引起了研究人员的广泛争议。

直到2008年，美国研究人员在《Science》杂志上报道了一种新的技术手段，可以非常安全地制造出多能干细胞。来自马萨诸塞州总医院、哈佛干细胞研究所等机构的科研人员，利用不会被整合到宿主细胞基因组内的普通感冒病毒——腺病毒为载体，把4个特定的基因植入实验鼠皮肤细胞和肝细胞中，成功培养出了多能干细胞。观察发现，采用这种方法培养出的多能干细胞不会使宿主细胞出现永久性基因损伤。除了逆转录病毒和腺病毒以外，研究人员还找到了一种新的载体进行干细胞的相关研究。

2008年《Science》杂志报道称，日本研究人员利用质粒代替病毒转导基因，成功地将实验鼠体细胞培育成诱导多能干细胞。研究人员称，以前培养诱导多能干细胞时，需要依靠逆转录病毒或慢病毒将Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc这4个基因导入体细胞，而使用病毒有可能引发肿瘤形成。利用质粒来做载体，可以避免每次实验都要重新做携带基因的病毒，更重要的是避免了引起肿瘤的危险。京都大学山中伸弥教授的研究小组在实验中使用了两个质粒来做载体，一个质粒携带c-Myc基因，另一个质粒携带Oct3/4、Klf4和Sox2基因，然后将质粒导入实验鼠胚胎成纤维细胞，成功培育出了诱导多能干细胞。这种新培育出的诱导多能干细胞与以往通过逆转录病毒转导培育出的多能干细胞具有一样的生物学特性。但用质粒做载体转化效率比用逆转录病毒为载体要低一些。

载体数量从四个到一个，简化了iPS的生成

自从2007年日本京都大学的Yamanaka研究小组成功完成人类诱导多能干细胞研究以来，研究者正不断在iPS领域取得积极进展。在早期的研究中，科学家需要用四个独立的病毒才能将基因转移到细胞的DNA中，每个病毒对应一个重组基因，分别是Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4。激活后，这些基因可以将成年状态的细胞分化成类似于胚胎干细胞的状态。但是这些病毒也可能会将DNA植入细胞基因组中任何一个地方，从而引发致癌基因的表达。所以对于有望被用于人类疾病治疗的诱导多能干细胞技术，科学家必须寻找到病毒的安全替代物。

用单一的病毒获得iPS的新技术在消除潜在的危害方面取得了重要进展。2009年美国怀特海德（whitehead）生物医学研究所的科学家在《Proceedings of the National Academy of Sciences》发表文章称，他们成功地将基因重组过程中所需要的病毒数量从四个减少到一个，从而极大的简化了iPS的生成。研究人员尝试将四个重组基因利用含有2A缩氨酸遗传密码的DNA串联起来，获得了具有多顺反子性的病毒。该病毒被植入成年实验鼠和人类细胞的基因组后，就有能力表达所有四个重组基因。利用这种串联基因，研究人员制造出仅包含此多基因性载体的单一拷贝，而不是多重病毒整合而成的诱导多能干细胞。但研究人员也发现，虽然可用单一病毒将四个基因整合到同样的位置，但效率却比再编程方法降低了100倍。

基因数量从四个到一个，iPS安全性的新突破

2007年11月，Yamanaka研究小组利用基因重组技术，将Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4四个转录因子基因导入到人类皮肤成纤维细胞中, 成功获得了iPS细胞。同年，美国威斯康星大学的Thomson研究小组利用了Oct4、Sox2、Nanog和Lin28四个基因，成功将人类成体细胞转化为干细胞，成为iPS 细胞。这两个在干细胞研究领域做出卓越贡献的研究团队不约而同地提到了同一个现象，即Oct4和 Sox2在诱导多能干细胞过程中可能是关键基因。在前期研究中发现，导入c-Myc基因可使小鼠发生肿瘤危险性增高。2008年，哈佛大学的Danwei Huangfu等人用两个转录因子基因Oct4和Sox2，配合组蛋白脱乙酰基酶抑制剂——丙戊酸能有效地重新编程人类成纤维细胞生成诱导多能干细胞。

2008年《Nature》杂志刊登了Kim等人最新的研究结果。研究发现，只用其中两个转录因子基因（Oct4 加上Klf4或c-Myc），就可以从成年小鼠神经干细胞中生成诱导多能干细胞。研究人员认为，因为这些神经细胞比胚胎干细胞表达更高水平的内源性Sox2 和 c-Myc。研究人员希望能用最少的基因生成诱导多能干细胞。在2008年，Kim等人创造了诱导多能干细胞生成的新方法，在2009年Kim等人又再接再厉，将转录因子基因数减到了一个，只需要Oct4就可以生成诱导多能干细胞。研究人员以逆转录病毒为载体将Oct4转导到小鼠神经干细胞中，获得了诱导多能干细胞。获得的诱导多能干细胞在体外转变成神经干细胞，或者变成心肌细胞、生殖细胞。在这项研究中，唯一美中不足的问题就是利用一个转录因子生成诱导多能干细胞的成功率比较低。这项最新的研究成果发表在2009年2月《Cell》杂志上。

基因数量的减少，尤其是去掉了Klf4和c-Myc这两个致癌因子基因，使发生癌症的可能性大大降低。再配合上由逆转录病毒向质粒载体的转化过程，诱导多能干细胞在临床上的应用指日可待。在研究人员翘首企盼的过程中，仍旧不忘记在临床应用上的大胆探索。在临床研究中也不乏一些获得突破性进展的例子。

干细胞临床应用效果

澳大利亚国家健康与医学研究委员会于2008年9月16日，批准了3个为期3年的克隆胚胎研究。不过这次的目的不是为了发展生殖技术，而是以治疗为目的，旨在培养人类多能干细胞。由此，澳大利亚正式开展了克隆治疗技术的竞赛，希望能在世界克隆技术领域取得领先地位。

2008年《Lancet》杂志刊登了世界首例自身干细胞人造气管移植成功的报道。需要进行气管移植的是一位女性患者。多个国家科研人员从脑死亡的捐赠者身上取一截气管，用一种新技术对气管进行6个多星期的处理，去除细胞。然后提取女性患者自身骨髓中的干细胞并在英国布里斯托大学Martin教授的实验室内进行细胞扩增，随后Anthony教授将细胞分化成软骨细胞。在处理过的捐赠者气管外种植软骨细胞，然后将人造气管替换患者的气管。

2008年的《Cloning and Stem Cells》杂志上发表了中国研究者在干细胞临床研究中的突破。研究者选择了12名健康志愿者捐献卵细胞，经促排卵方法获得135枚卵细胞，最终成功获取囊胚5枚。其中4枚囊胚供体细胞来源于正常人皮肤纤维细胞，1枚来源于帕金森氏病患者外周血淋巴细胞。

2009年6月3号《Journal of Molecular Cell Biology》网络版报道，来自上海生物化学与细胞生物学研究所干细胞实验室的肖磊等，通过一种病毒将转录因子引入来自一头猪的耳朵和骨髓的细胞，从而成功培育出了诱导多能干细胞，该细胞具有再分化为内胚层、中胚层和外胚层细胞的能力。这是全世界首次使用有蹄类动物的体细胞成功诱导多能干细胞。该研究为建立人类遗传病模型、培育供人类器官移植的转基因动物以及开发耐受猪流感等疾病的猪开创了一条道路。

2009年1月23日，美国食品和药品管理局首次批准将胚胎干细胞应用于人类疾病的治疗。美国杰龙生物医药公司获准为数位因脊柱受伤导致下肢瘫痪的患者注射人类胚胎干细胞，并于今年夏天开始研究其成效。干细胞的研究和临床应用可以为患者带来福音，可以用来治疗目前的许多疑难杂症。

前景展望

1996年7月5日，第一个用成年体细胞克隆产生的哺乳动物——绵羊多莉（Dolly）诞生，标志着干细胞应用的新里程。但当时采用的是核转移技术，此种技术操作复杂，成功率低，更多的是会带来一系列的伦理问题。

避开胚胎干细胞所引起的伦理问题，研究人员找到了iPS，这是一种具有突破性的研究方法，从理论上讲，这种新方法可以治疗各种疾病。现在的技术可以利用自体的体细胞转化成iPS，治疗自身疾病。除此之外，干细胞还可以用于组织工程学，比如世界首例人造气管的移植。

新干细胞技术的产生和应用，无疑是对传统医学的一场革命性突破。可以预测在不久的将来，干细胞研究和应用可以在目前的基础上更完善。不但可以避免移植排异、携带基因诱发肿瘤等一系列问题，最主要的是可以帮助患者解除痛苦，延长患者生命，治疗一些目前无法治愈的疾病。